分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。
分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源,光源透过测试的样品后,部分光源被吸收,计算样品的吸光值,从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是使用频率较高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA,以及RNA。核酸的zui高吸收峰的吸收波长260nm。每种核酸的分子构成不一,因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数。如:1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度。测试前,选择正确的程序,输入原液和稀释液的体积,尔后测试空白液和样品液。然而,实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者zui头痛的问题。灵敏度越高的仪器,表现出的吸光值漂移越大。
使用事项说明:
1.应放在干燥的房间内,使用时放置在坚固平稳的工作台上,室内照明不宜太强。热天时不能用电扇直接向吹风,防止灯泡灯丝发亮不稳定。
2.使用前,使用者应该首先了解结构和工作原理,以及各个操纵旋钮之功能。在未按通电源之前,应该对安全性能进行检查,电源接线应牢固,通电也要良好,各个调节旋钮的起始位置应该正确,然后再按通电源开关。
3.在尚未接通电源时,电表指针必须于“0”刻线上,若不是这种情况,则可以用电表上的校正螺丝进行调节。
重要配件——比色杯
比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积,有比色杯和毛细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白,均采用石英杯或者玻璃杯,但是不适合比色法测定。因为反应中的染料(如考马斯亮兰)能让石英和玻璃着色,所以必须采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。
由于另外测试的样品量不同,所以一般厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量,亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯,样品用量仅需50μl,比色杯单个无菌包装,可以回收样品。如EppendorfUVette®塑料比色杯,是目前比色杯市场上一个革新。随着生命科学以及相关学科发展,对此类科学的实验研究提出更高的要求,分光光度计将是分子生物学实验室*的仪器,也成为微生物、食品、制药等相关实验室的*设备之一。